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PCR实验室建设所需资料

426日,国家卫健委举办全国视频会议,明确提出所有县区级以上疾控机构、二级以上综合医院要抓紧进行改造,在短时间内形成核酸检测能力426日,国家卫健委举办全国视频会议,明确提出所有县区级以上疾控机构、二级以上综合医院要抓紧进行改造,在短时间内形成核酸检测能力

各地的公立机构检测能力不能满足需求只是暂时的,独立医学实验室在充实检测力量的同时,发挥自己丰富的检验管理运营理念,以及区域化覆盖的经验优势,融入到国家队核酸检测能力的建设中,顺势而为,乘势而上。

随着各地都在建立PCR实验室,本文从硬件基础的角度,梳理了PCR实验室建设的几个关键点,独立医学实验室可以运用丰富的运营经验,进行建设指导、人员梯队建立、质控体系搭建、区域化服务支持等。

如何建设PCR实验室

PCR实验室建设相关的指导文件主要有四份:

《医疗机构管理条例》

《医疗机构临床实验室管理办法》

《临床基因扩增检验实验室管理暂行办法》

《医疗机构临床基因扩增实验室管理办法》

要求临床PCR实验室,不但在实验室设置及仪器设备等硬件上要满足开展临床检验的条件,而且要求实验室在日常工作要有文件化的工作程序。

下面就在PCR实验室建设过程中的几个关键控制点进行阐述:

01建立PCR实验室质量管理体系

根据实验室的具体情况编写质量体系文件,《质量手册》、《程序文件》、《作业指导书》,并保证管理体系运行有效。

管理体系的特点是应有明确的目的、规范的管理、有效的制约、高效的机制、能自我发展的整体。

建立完善的SOP文件,对完成各项质量活动的方法作出规定,每个SOP都应对一个或一组相互关系的活动进行描述。

每个SOP文件应说明该项质量各环节的输入、转换和输出所需的文件、物资、人员、记录以及它们与有关活动的接口关系。

明确每个环节转换过程中各项因素的要求,即由谁做、做什么、做到什么程序、达到什么要求,如何控制、形成什么记录和报告,以及相应的审批手续。

规定在质量活动中需要注意的例外或特殊情况的纠正措施。SOP应简练、明确和易懂并且工作人员熟练掌握和严格遵守。

02PCR实验室的相关设置 

要完成一组PCR实验,通常需要经过试剂配制、样品处理、核酸扩增和产物分析4个实验过程。

4个实验过程的实验用房应相邻布置,组成一个独立的PCR实验区。标准的PCR实验区包括:试剂准备区、标本制备区、扩增区、产物分析区、各区配套的缓冲区及公共走廊。

PCR实验室整体平面布局

某医院PCR实验室平面布局如图1所示,整个区域有一个公用走廊,每个独立实验区设有专门的缓冲区。通过压差控制,使整个PCR实验过程中试剂和标本免受气溶胶的污染,并且降低扩增产物对人员和环境的污染。



        图表1、某医院PCR实验室平面图



试剂准备区

该实验区主要进行的操作为贮存试剂的制备、试剂的分装和主反应混合液的制备。

试剂和用于标本制作的材料应直接运送至该区,不得经过其他区域。试剂原材料必须贮存在本区内,并在本区内制备成所需的贮存试剂。

试剂准备区配备有2~8°C冰箱和-80°C冰箱,计算冷负荷时,需要将它们计算在内。

房间的面积宜控制在15m2~20m2。本区的压力梯度要求为:相对正压状态,以防止外界含核酸气溶胶的空气进入,造成污染。

标本制备区

该区域主要进行的操作为临床标本的保存、核酸(RNADNA)提取、贮存及其加入至扩增反应管和测定RNAcDNA的合成。

标本制备区配备有2~8°C冰箱和-20°C冰箱,计算冷负荷时,需要将它们计算在内。在标本制备区,还需要配备生物安全柜,用于进行提取核酸的操作。

为避免提取的核酸在柜内反复循环,造成标本之间的交叉污染,出现假阳性结果,该区域配备的生物安全柜必须是B2型的。生物安全柜工作区垂直气流全部来自实验室,排风经过高效过滤器(www.rfilter.com)过滤后直接排至室外,不允许回到安全柜和实验室中。

根据经验,如果实验室内配备生物安全柜,每配备一台,实验室的面积增加10m2;标本制备区的面积宜在25m2~30m2之间。本区的压力梯度要求为:相对于邻近区域为正压,以避免从邻近区进入本区的气溶胶污染。

扩增室

该区域主要进行的操作为DNAcDNA扩增。此外,已制备的DNA模板和合成的cDNA(来自样本制备区)的加入和主反应混合液(来自试剂贮存和制备区)制备成反应混合液等也可在本区内进行。

在巢式PCR测定中,通常在第一轮扩增后必须打开反应管,因此巢式扩增有较高的污染危险性,第二次加样必须在本区内进行。

扩增室主要配备PCR实验室的核心仪器PCR仪,本文实例中使用了ABI7500ABI9700两种PCR仪。

在实验室建造过程中,需要给PCR仪配备专门的UPS电源,以保证其正常工作。该区面积控制在15m2~20m2

本区的压力梯度要求为:相对于邻近区域为负压,以避免气溶胶从本区漏出。为避免气溶胶所致的污染,应尽量减少在本区内的不必要的走动。个别操作如加样等应在超净台内进行。建议采用5~10Pa压差,在控制上比较容易实现。

产物分析区

该区域主要进行的操作为扩增片段的测定。如使用全自动封闭分析仪器检测,此区域可不设。

在室内配备通风橱,保证房间内的相对负压,空气从室外流向室内。该区面积控制在15m²~20m²

本区是最主要的扩增产物污染来源,因此对本区的压力梯度的要求为:相对于邻近区域为负压,以避免扩增产物从本区扩散至其它区域。建议采用5~10Pa压差,在控制上比较容易实现。


03正负压区域缓冲室的设置 

根据压力梯度的要求,试剂配制室和样品处理室为相对正压,扩增室和产物分析室为相对负压,要求正压的区域和要求负压的区域的缓冲室内的压力设计大不相同。

正压缓冲室符合一般正压洁净室的缓冲原则,主要是防止室外环境空气中的气溶胶进入室内。正压缓冲室的布置如图2所示。


图表2、正压缓冲室的布置图



负压缓冲室则是要求缓冲室对核酸扩增室及产物分析区保持正压,对缓冲室外也保持正压(主要是满足室内净化需要,如室内无洁净要求,此处可以为0)。负压缓冲室的布置如图3所示。



图表3、负压缓冲室的布置图

04污染的预防与控制

PCR实验室设计的核心问题是如何避免污染。在实际工作中,常见的有以下几种污染类型:扩增产物的污染;天然基因组DNA的污染;试剂的污染以及标本间的污染。因此要避免污染,首先应是预防,而不是排除。

工作区域的严格划分,各个实验区域要有明显的标记(如醒目的门牌或不同的地面颜色等),以避免各个不同实验区域设备物品、试剂等发生混淆。

合理的系统设置,合理的空调通风系统设置,尽量采用全送全排的空调系统;严格的气流压力控制,保证不同的实验区内不同的压力要求。

规范的操作,临床基因扩增检验实验室的技术人员必须进行上岗培训,在实验操作过程中,操作者必须戴手套,并经常更换。清洁工作及时、正确。实验工作结束后,必须立即对本区进行清洁。

严格的管理:严格控制进出实验室的人员。在各个实验区域使用带有明显区别标志的工作服(如不同颜色),当工作人员离开时不得将本区的工作服带至其它区域;尽量减少在实验区内不必要的走动以减少交叉污染的可能性。扩增产物分析区是最主要的扩增产物污染来源,废液不能在实验室中倾倒,必须经消毒液浸泡消毒后在远离实验室的地方弃掉,用过的吸头等一次性材料也应经消毒液浸泡消毒后统一处理,如焚烧等;

总之,实验室建设是一个复杂的问题,这里不讨论人员的问题,实验室人员的培养与沉淀,也需要一个过程,在建设的过程中要因地制宜,不要生搬硬套,结合自己的实际慢慢摸索出适合自己发展的建设思路。科学合理建设实验室,更好的发挥实验室的作用。 




来源:独立医学实验室资讯、小桔灯网

作者:蓝天

参考资料:

[1] 中华人民共和国住房和城乡建设部,中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局.GB50591-2010,洁净室施工及验收规范[S].北京:光明日报出版社,2010.

[2] 许钟麟.空气洁净技术原理(3)[M].北京:科学出版社,2004.

[3] 《临床基因扩增检验实验室管理暂行办法》(卫医发[2002]10).

[4] 刘书庆,谢逢洁.质量管理体系建立与实施维护[J]工业工程,2003.

[5] 2010年,卫生部办公厅关于印发《医疗机构临床基因扩增实验室管理办法》的通知.

 




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